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Leukos超连续谱激光器在显微成像领域的前景

作者:admin  时间:2021-11-16 9:31:29

普通的显微镜包含传统宽场荧光显微镜、共聚焦显微镜、双光子显微镜等等。法国Leukos超连续谱激光器的超连续谱光源波长范围在可见光及近红外区域,覆盖范围广,可以用于双光子成像,在超连续谱显微成像检测方面有优势,还可以用于其他多种应用。

一、双光子显微镜:

由于多光子显微镜在深层组织成像方面的显着优势(长波长穿透性强,且在焦平面之外的光束无光学反应,更多的激发光到达焦平面),亚细胞分辨率和光漂白效应的影响有限(长波长的红外光细胞毒性小)。因此它逐步取代了通常的共聚焦显微镜系统,且双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。


上面左图代表了超连续谱激光双光子的实验装置,基于奥林巴斯(BX61WI)的商业双光子显微镜,带有标准的基于电流计的扫描系统,二色镜,过滤器和光电倍增管(PMTs)。纳秒超连续谱激光器由一个脉冲泵浦激光器和1米长的实心PCE组成,泵浦激光器输出1ns脉冲,波长1550nm,重复频率为250kHz超连续光谱范围在500nm~2000nm。整个过程由计算机驱动,图像被重建。

上面右图代表了具有纤维结构的小鼠腿肌的样品。已知肌球蛋白组织具有二次谐波产生(SHG),通过免疫组化和AlexaFluor546的二抗标记,可确定了α-肌动蛋白(细胞骨架肌动蛋白结合蛋白)。图la和1d为α-肌动蛋白图像,图1b和le与肌球蛋白组织有关,图1c和1f表示全场和相对定位。


如上图,(a)代表激发光谱图像。在实验中,我们用氯胺酮/氧嗪麻醉的小鼠的大脑进行了活体成像,将稳定表达eGFP的胶质瘤细胞(GL261)被移植到小鼠的大脑中。肿瘤细胞被检测到,且TexasRed@共轭右旋糖酐(70kD)被注射到尾静脉,使皮层血管形象化,在(b)中,可以看到肿瘤细胞周围血管组织在几周内的演变。TexasRed@的双光子吸收光谱集中在840nm处,而eGFP的双光子吸收光谱集中在920nm处。


二、共聚焦显微镜:

通过物镜,传统宽场荧光显微镜可以对焦平面成像,但焦平面附近也有光线干扰,这意味着我们得到了部分不需要的图像,使成像分辨率效果降低;且获得了额外的光毒性,影响到样品生物活性,甚至可能造成细胞死亡;

与传统宽场显微镜相比,共聚焦显微镜有许多有点:高清晰度、高分辨率、高灵敏度等等。因为在与样品焦面共轭的光学平面上,有一个小孔,因此接收器只收集焦平面上的信号,图像因此由模糊变为清晰,分辨率(尤其是Z轴方向)也有所提高。

由于共聚焦显微镜使用点扫描方式成像,为得到较快光的扫描速度,光束照射每个点的时间很短,成像元件(PMT)的量子效率低,因此需要更强的激发功率,这就造成了更强的光漂白和光毒性。



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